一、实验目的
　　在肉眼或放大镜下所看到的是木材宏观构造特征，即木材细胞组织的形态特征。要观察木材细胞分子形态以及木材细胞胞壁特征，也即木材显微构造特征，则首先要将木材三个切面切成薄片并制成切片玻片，才能在生物显微镜下观察。如果需长期保存，要制成永久玻片；如果用于临时观察，无需长期保存，则制成临时玻片即可。本实验重点介绍木材永久玻片的制作方法，并要求学生掌握临时玻片的制作方法，以及生物显微镜的使用方法，为今后从事木材解剖研究与木材鉴定工作打好基础，练好技能。

二、实验设备、器具与药品
　　显微镜；木材切片机；磨刀机；切片刀、单面刀片；水浴锅、电炉；培养皿、解剖针、镊子、毛笔；载玻片、盖玻片。

三、实验材料
　　木材样品（标本）。酒精（工业酒精与无水酒精）、甘油、铁矾、蕃红、丁香油、二甲苯、中性树胶。

四、木材切片方法与步骤
　　（一）试样制备
　　1. 试样截取：试样最好自树干1.3m(胸高)以上正常部位截取。同时最好在靠近心边材交界处的心材或边材部分, 生长轮正常部位截取。试样最好不要同时具心材和边材,因为二者软化条件与时间不同,材色不一致, 心材切片比边材难。试样截取部位亦可视研究目的而定。试样尺寸弦、径、高为：20×20×20mm。
　　2. 试样修整编号：试样的弦面、径面、端面必须取正，并且必须刨平，相邻面必须相互垂直。最好用刻痕的方法编号，亦可用铅笔或号码机编号,避免试样处理后编号不清晰。

　　（二）试样软化
　　1. 试样排气：不管采用哪种软化方法，都要经过排除试样(木材)内的空气。一般用水煮至试样下沉为止。
　　2. 软化方法：
　　　　⑴ 水煮软化法：对于材质比较轻软的木材可直接水煮将其软化。该法软化木材，耗时太长。
　　　　⑵ 酒精－甘油软化法：试样水煮后用95%酒精、甘油各50%的混合液浸泡至试样软化。此混合液尚可作软化后试样的贮藏剂。
　　　　⑶ 双氧水－冰醋酸软化法：用工业双氧水和冰醋酸各50%的混合液浸泡至试样软化。亦可在水浴锅中加热至试样表面材色淡白或边缘开始离析为止。此法比较快速，是比较常用的软化法。
　　　　⑷ 氟氢酸（HF）软化法：此法有自细胞壁中溶解硅石的作用。但不侵蚀胞间质。又不溶解细胞腔内各种晶体。氟氢酸浸渍木材时间，随各种木材的构造、硬度，试样大小和氟氢酸浓度而不同而异。氟氢酸的浓度，一般用10% ～40％的水溶液，主要根据木材硬度而定。5O％以上则能溶解胞间质，所以很少使用。如欲使用，只能浸渍1～2天，否则易破坏木材。氟氢酸能侵蚀玻璃，经1小时侵蚀，深度约0.2mm。一般浸渍1～2个星期，很硬的木材， 需浸渍1～2个月才软化。试样软化后要在流水中漂洗2～3天。此法适用于比较重硬的木材，尤其适合含丰富沉积物的热带木材软化。
　　　　⑸ 醋酸纤维素法：试样在70%的酒精中浸渍1～2天后，移入纯丙酮2小时，溶去酒精；移入12%醋酸纤维素丙酮(醋酸纤维素12g, 丙酮100ml)中浸渍至软化。软化时间,轻软木材约1～2天；重硬木材约1～2星期。若能在水浴锅中加热至40oC，软化时间可明显缩短。试样软化后要在丙酮中溶去醋酸纤维素，然后置于酒精或水中备用。
　　　　⑹ 火棉胶(Colloidm或Cellodm)法：此法适用特别轻软的木材或出土木材软化。试样先经排空气和脱水。过程是：排空气→水洗→70%酒精→90%酒精→95%酒精、纯乙醚各半，共约4小时。然后置于火棉胶中，或称用火棉胶包埋。火棉胶是用固体火棉胶,以95%酒精、纯乙醚各半的溶液将其溶解而成。浸渍宜在45℃的温箱中进行，并经各种浓度火棉胶浸渍约48小时。具体过程是：→2%火棉胶→4%火棉胶→6%火棉胶→8%火棉胶→10%火棉胶→10%火棉胶液内逐渐加入固体火棉胶至火棉胶液不能流动为止，并于室温下包埋2天以上。最后将附有火棉胶的试样放置于纯氯仿(chloroform)中，经12～24小时后火棉胶凝成包埋块，并置于等量的甘油和酒精溶液中备用。
　　　　⑺ 电解软化法：将试样置于电解溶液中，并用水浴锅使软化过程恒温。
　　　　⑻ 超声波软化法：将试样置于水浴锅中，利用超声波仪进行木材软化。

　　（三）切片
　　1.切片刀安装：将切片刀紧旋在切片机的刀架中，并调整切片刀的刀刃与试样切面的角度。
　　2.试样安装：先将试样紧旋在切片机的试件夹中，然后，转动试件夹的螺旋，使被切的试样切面成水平面，并将螺旋拧紧。
　　3.切片操作：先调整试件夹螺旋，使试样切面接近刀刃，并将螺旋拧紧。然后，调整切片厚度上升刻度，擦上甘油，右手旋转滑动轮，左手用毛笔接片并置于盛有蒸馏水的培养皿中。

　　（四）制片
　　1.染色：由于各类细胞的胞壁厚薄不同，胞腔内含物有无与内含物种类不同，对不同的染色剂会发生不同的物理、化学反应，各类细胞的胞壁或胞腔内含物会呈现不同的颜色。根据这一原理，可对切片进行多重染色。但由于木材细胞胞腔通常无内含物，所以木材切片通常用蕃红染成红色。染色前，先将切片用蒸馏水冼干净，后将切片置于盛有蕃红染液的培养皿中，染色时间随切片的厚度及树种而定。染色流程为：蒸馏水漂冼（3～5次）→铁矾液（10min）→蒸馏水漂冼（3～5次）→蕃红染液（0.5d～2d）。
　　2.脱水：先将切片用蒸馏水漂冼干净，后将切片置于培养皿中。然后用不同浓度的酒精，除净切片材料中的水分。如果切片材料中有水，会使透明剂发生乳白色胶状物，从而影响切片材料的透光直至切片的观察效果。脱水流程为：漂洗（除去染液）→30％酒精（5min）→50％酒精（5min）→70％酒精（5min）→90％酒精（5min）→无水酒精（10min）→无水酒精（保存至下道程序）。
　　3.透明：为了使切片的透光性加强，需要对切片材料进行透明处理。常用的透明剂为丁香油和二甲苯。透明流程为：丁香油（10min）→丁香油（5min）→二甲苯（5min）→二甲苯（保存至下道程序）。
　　4.封片：将干净的载玻片放置在定好位置的纸托上，定位是根据切片大小，切片大的，每张盖玻片只封一个切面的切片，三个切面的切片并排在一张载玻片上；切片大的，三个切面的切片可同时封在一张盖玻片中。在预定好的位置上滴上一滴中性树胶，用镊子将切片从二甲苯中取出放置到载玻片的预定位置上。再加少量树胶，用镊子将盖玻片把切片盖好。操作时，用镊子将盖玻片的一边先与载玻片接触，并慢慢地将盖玻片把切片盖好，使树胶均匀分布在盖玻片内。然后用镊子施加压力，排除盖玻片内的气体，但又要防止树胶溢出盖玻片范围外。在载玻片上贴上标签，放置阴干，亦可低温烘干。整个制片的工作宣告结束。
　　
　　（五）临片玻片制作方法
　　1.试样制备与试样软化：与永久玻片制作方法相同。甚至试样可以不经软化处理。
　　2.徒手切片：临片玻片要求的切片大小、厚薄都不很严格。所以，可用单面刀片代替切片刀。徒手切片时，右手握刀片，刀口向内，左手握标本，刀片于拟切部位自左上向右下拖动，一气呵成。并将切片置于盛有蒸馏水的培养皿中。
　　3.染色：将切片漂洗2～3次后置于盛有蕃红染液的培养皿中，染色10min。
　　4.脱水：将经染色切片用蒸馏水漂冼干净，后将切片置于培养皿中。然后用不同浓度的酒精，除净切片材料中的水分。程序与永久片的脱水相同。
　　5.透明：为了增强切片的透光性，也可对切片进行透明处理，但只需经1～2次二甲苯处理即可。
　　6.临时封片：取干净的载玻片，并在载玻片中央滴上1小滴甘油，用镊子将切片放置到载玻片中央有甘油的位置上。用镊子将盖玻片把切片盖上即可观察，注意不要让甘油弄脏载玻片及盖玻片。

五、显微镜的构造与使用方法
　　(一)显微镜的构造
　　显微镜的构造可分为机械部分和光学部分：
　　1. 显微镜的机械部分
        ⑴镜座：镜座是显微镜的底座，它的作用是支撑整个显微镜。
        ⑵ 镜臂：镜臂的作用是支撑镜筒。
        ⑶ 镜筒：镜筒是一个金属圆筒，连接在镜臂的上端，镜筒上端放置目镜，下端连接物镜，镜筒长度常用的为160或170毫米。我们使用时，就要注意这一点。
        ⑷ 物镜转换器：物镜转换器固定在镜筒下端，是一个能旋转的圆盘，其上一般可装3个接物镜头。当每次转换接物镜时，为了使接物镜与上面的光轴对准，所以在转换器的每个镜头安装处。各刻有一个小槽，并由转换器上端的弹簧夹嵌住它，当每次转换时，需使弹簧夹落入小槽中，否则就会造成不合光轴的偏象，如相差过远时，往往不能成像。
        ⑸ 粗调焦螺旋：镜筒的上下移动是依靠两种螺旋（齿轮）来控制的，能使镜筒移动较大范围的是粗调焦螺旋，能使其移动较小范围的是细调焦螺旋。反时针方向扭转粗调焦螺旋，镜筒即向上移动，顺时针方向扭转时，镜筒即向下转动。
        ⑹ 细调焦螺旋，它的结构非常精细，转时应该细心，不要连续急转，以免损坏齿轮，不易修理，细调焦螺旋每转一周，镜筒移动0．lmm。
        ⑺ 聚光器调动螺旋，它可以操纵聚光器上下移动，借以调节光线。
        ⑻ 载物台：载物台的作用是安放载玻片，它的中心有一个通光孔，通光孔后方左右侧各有一个安装片夹的小孔。载物台可左右前后移动。
　　2．显微镜的光学部分
        （1）接物镜：它是一个由金属制成的圆筒，里面装有几个透镜，这些透镜是由一些特殊的胶粘在一起的，有一些高级接物镜是由12块透镜组成的，一般较低倍的接物镜，其镜比较短（如 10倍的），而较高倍的接物镜，其镜筒就比较长（如 45倍或 62倍的），油浸接物镜的镜筒则特别地长（如90倍或100倍）。
        在接物镜筒上刻有倍数如 10X、 40X、 100X，就是10倍、 40倍、100倍的意思。有的只刻厂家的镜头号码，如3号，7号，这时就需要找显微镜卡片查对倍数。同时在镜筒上还可以看到N、A零点几，这就表示开口率为多少。开口率是光线投射到接物镜上最大角度之半的正弦乘上接物镜与盖玻片之间介质的折光率所得的乘积，借以表示该物镜的扩大效能，低倍接物镜开口率较小，高倍接物镜的开口率较大，油镜接物镜的开口率更大（NA为1.3或1.4）。
        （2）接目镜：接目镜安装在镜筒的上端，它也是一个金属的圆筒，圆筒的上下端各有一片透镜，如接目镜镜筒较长，其放大倍率较小，接目镜镜筒较短的，其放大倍数则较大。
物像放大倍数的计算一般是接目镜倍率乘上接物镜的倍率，例如接目镜是10倍，接物镜也是10倍，则总的放大倍率为100倍。
        （3）聚光器：由一片至多片透镜组成，其上的透镜适嵌于载物台中央圆孔的下面，它可把光线集中到所要观察的标本上，聚光器可以上下调节，以求光度适宜。普通观察时一般采用开口率（N.A）为1.2的聚光器，聚光器上附有红彩光圈，借以调节光线的强弱，缩小光圈宜于观察无色透明的标本，如开放光圈宜于观察颜色较深的标本。聚光器最下面有一个能够移动的金属圈，其糟内可以加滤光玻璃，使用灯光时需用兰色滤光玻璃。
        （4）反光镜：位于聚光器的下面，它可以把光线反射到聚光器。反光镜有两面，一面平，另一面凹，凹面镜反光强，在光线较弱时使用此镜，平面镜反光较弱，在光线较强时使用，反光镜具有关节。可以向各方向移动，用以接受光线。
　　
　　(二) 显微镜的使用方法
　　使用显微镜时，首先将低倍接物镜旋转与镜筒成一直线，将反光镜对向光处，使光线反射入镜筒，用手放大虹彩光圈，如光线很强再逐渐缩小光圈，直至光度适宜为主。
　　光对好后，将切片放在载物台上，两手将压片夹从两端轻轻压住切片，不要使压片弹打玻片，以免打碎大盖玻片，再将欲观察的材料对准载物台上圆孔的正中，然后用右手转动粗调焦螺旋，将接物镜降至与载物台上切片距离2-3mm为止，然后再用眼对准接目镜注视镜内，同时将镜筒徐徐上升（切勿急使镜筒向下），一直到看见镜中成像为止，如不够清晰，可用细调焦螺旋调节之，这时再调节光圈，使光线适合要求，如物像不在视野中央，可移动切片，显微镜视野的成像都是倒像，切片移动的方向与成像移动的方向恰好相反。
　　必要时可以使用高倍接物镜，当在低倍接物镜中把物像对准后转动转换器，使高倍接物镜移至中央，然后由接目镜向下观察所见的物像，所见到的物像往往不甚清楚，此时需用左手先向上方轻轻转动细调焦螺旋，使镜筒稍上升，物像就清楚了，如物像反趋模糊，则需向下移动细调焦螺旋，物像就可以清晰。
　　使用高倍接物镜时，一定要严格遵守先用低倍寻找，再换高倍观察的规则。使用显微镜时应注意下列各事项：
        （1）取用显微镜之前，应根据显微镜记录卡片，逐次检查，防止零件有所遗失。
        （2）取镜时一手把持镜臂，另一手托住镜座，不可斜提，防止接目镜由镜筒滑出。
        （3）应该轻轻将显微镜放在桌上，置放时先将镜座前脚轻轻着落，然后再放下整个镜座，切勿引起镜身遭受剧烈震动。
        （4）显微镜的倾斜关节虽然倾斜角度很大，但使用时不宜超过45°。
        （5）使用高倍和油浸接物镜时，观察新鲜材料的切片时一定要加盖玻片，假如观察用酸处理过的材料时，即使是用低倍接物镜。也须加盖玻片以免酸侵蚀镜筒或载物台，高倍及油渍接物镜用毕时一定要转开镜头，然后撤除切片，以免磨着镜头。
        （6）显微镜所有的镜片光学部分都必须用特制的镜头纸擦试，不能用手绢或一般纸擦试以免损伤镜片。